JMC | 靶向细胞外ATP：外用氯盐在特应性皮炎小鼠模型的评估验证

摘要

特应性皮炎以慢性炎症、屏障功能障碍和瘙痒为特征，搔抓等外界刺激会加重上述症状。

2024年11月，九州大学医学研究生院皮肤科的Takeshi Nakahara等研究团队在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上发表了题为“Extracellular ATP Contributes to Barrier Function and Inflammation in Atopic Dermatitis: Potential for Topical Treatment of Atopic Dermatitis by Targeting Extracellular ATP”的研究。该研究探讨了细胞外在特应性皮炎病理生理中的作用，并评估了ATP释放抑制剂氯LSY对特应性皮炎的药物潜力。

研究表明，细胞外ATP会降低角质形成细胞中丝聚合蛋白的表达，而丝聚合蛋白是维持皮肤屏障完整性的关键蛋白，因此细胞外ATP会损害皮肤屏障功能。此外，白细胞介素-4和机械刺激会触发ATP释放，进而促进免疫细胞产生细胞因子和趋化因子，加剧炎症反应。氯LSY可通过抑制ATP释放，恢复角质形成细胞中的丝聚合蛋白水平，减少树突状细胞产生胸腺活化调节趋化因子，并改善特应性皮炎小鼠模型的症状。这些发现表明，靶向细胞外ATP有望成为改善特应性皮炎皮肤屏障功能和减轻炎症的新研究策略。未来研究应进一步探索靶向ATP在临床场景中的长期疗效与安全性。

 

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研究材料与仪器

 

材料

细胞、ATP、IL-4、氯LSY、MC903、荧光素-荧光素酶试剂、TRIzol试剂、RNeasy Plus Micro Kit、PrimeScript RT 试剂试剂盒、TB Green Premix Ex Taq、鼠源CCL17/TARC ELISA试剂盒、中性福尔马林、乙醇

实验动物：8周龄雌性C57BL/6小鼠

 

仪器

荧光素-荧光素酶检测相关设备、DTX 800多模式检测仪、CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统、数字卡尺、伊红染色相关设备、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、GraphPad PRISM 5软件。

 ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

 

实验过程

 

体外实验

1. 细胞培养：正常人类表皮角质形成细胞在添加牛垂体提取物、重组人表皮生长因子等成分的KGM-Gold培养基中培养，待细胞融合度达70%–80%时传代，取第三代细胞进行后续处理。分离C57BL/6小鼠骨髓细胞，在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的RPMI-1640培养基中培养，第10天收集非贴壁细胞，通过CD11c免疫磁珠阳性分选获得纯度95%–97%的骨髓来源树突状细胞。

2. 体外角质形成细胞划痕模型建立：将正常人类表皮角质形成细胞接种于6孔板，待细胞形成完整单层后，用1000μL移液枪头划痕，划痕后孵育15分钟用于检测细胞外ATP，孵育24小时用于荧光定量PCR检测。

3. 细胞外ATP浓度测量：收集细胞培养上清液，离心后取上清，加入荧光素-荧光素酶试剂，通过化学发光法检测ATP浓度。

4. 荧光定量PCR检测：提取细胞或小鼠耳部皮肤组织的总RNA，反转录合成cDNA，采用TB Green Premix Ex Taq进行实时荧光定量PCR，检测丝聚合蛋白、TARC及各类细胞因子的mRNA表达水平。

5. 酶联免疫吸附试验：收集骨髓来源树突状细胞培养上清液，使用鼠源CCL17/TARC ELISA试剂盒检测TARC蛋白含量。

 

体内实验

1. 尘螨抗原诱导的小鼠特应性皮炎模型建立：将小鼠分为对照组、特应性皮炎组、特应性皮炎。特应性皮炎组和特应性皮炎小鼠双耳涂抹含MC903的乙醇溶液，5小时后特应性皮炎涂抹氯LSY溶液，特应性皮炎组涂抹溶媒；对照组涂抹乙醇。连续5天上述处理后，两组均每日涂抹对应试剂至第10天。

2. 小鼠耳部厚度测量：每日使用数字卡尺测量小鼠耳部厚度，记录变化情况。

3. 组织学检查：取小鼠耳部皮肤，用10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片，进行染色，观察表皮厚度和真皮内炎症细胞浸润情况，统计炎症细胞数量和表皮厚度平均值。

4. 经表皮失水量测量：使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪，在标准温湿度环境下测量小鼠皮肤病变部位的经表皮失水量。

使用Vapo Scan仪器在第0、2、4、6天测量病灶处 TEWL

 

5. 统计分析：所有数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析结合Bonferroni多重比较检验分析组间差异，P＜0.05视为差异有统计学意义。

 

结论

细胞外ATP会降低角质形成细胞中丝聚合蛋白的表达，损害皮肤屏障功能；IL-4和搔抓等机械刺激会促进角质形成细胞、树突状细胞释放ATP，进而加剧特应性皮炎的炎症反应。而氯LSY可通过抑制囊泡核苷酸转运蛋白来阻断ATP释放，能够恢复IL-4或搔抓导致的丝聚合蛋白表达下降，减少树突状细胞产生TARC。外用氯LSY可改善尘螨抗原诱导的特应性皮炎小鼠模型的耳部肿胀、红斑、鳞屑等症状，降低表皮厚度和炎症细胞浸润程度，改善皮肤屏障功能。靶向细胞外ATP有望成为特应性皮炎研究新方向，既能改善慢性症状，也可能缓解由外界刺激引发的急性加重症状。